MECCANISMI REDOX DI SEGNALAZIONE
CELLULARE COINVOLTI NELLA GENESI DI MALATTIE ASSOCIATE A STRESS OSSIDATIVO
Le cellule comunicano tra loro e
rispondono agli stimoli extracellulari attraverso meccanismi biologici, che
trasformano l’informazione in una modificazione chimica; processo che viene
indicato con il nome di segnalazione cellulare o trasduzione del segnale ed è
una proprietà universale delle cellule viventi.
Accanto alla ben nota segnalazione
a cascata fosforilativa che regola diverse funzioni e risposte cellulari,
recentemente, si è evidenziata una modalità di trasduzione del segnale a
carattere redox, mediata dalle specie reattive dell’ossigeno (ROS) e
dell’ossido nitrico (NO).
Le risposte cellulari indotte dai
ROS includono l’espressione e la sintesi di citochine, fattori di crescita ed
ormoni, con conseguente impatto sul ciclo cellulare, differenziamento,
resistenza, senescenza e morte per apoptosi.
Alla base di tutte queste possibili
risposte della cellula vi sono verosimilmente modificazioni discrete dello
stato redox cellulare che determinano l’innesco di segnali molecolari definiti
e la loro trasduzione al nucleo.
Le unità operative coinvolte nel
presente progetto si occupano da anni di diversi aspetti correlati alle
alterazioni dello stato redox in diversi modelli sperimentali riconducibili a
patologie di grande impatto per la salute quali cancro, aterosclerosi e
neurodegenerazione o a condizioni fisiologiche quali invecchiamento e
senescenza cellulare.
Pertanto, lo scopo che intendono
raggiungere, nel presente programma di ricerca, è quello di chiarire i
principali meccanismi tramite cui i ROS, così come molecole derivate dalla
reattività di questi (specie reattive dell’azoto, RNS; ossisteroli; disolfuri)
innescano segnali cellulari fisiologici e/o fisiopatologici coinvolti nella
genesi di malattie associate a stress ossidativo.
In particolare, il progetto di
ricerca prevede di analizzare i segnali redox intracellulari che funzionano da
veri e propri induttori molecolari, valutando: i)i processi di S-tiolazione e
S-nitrosilazione che rappresentano gli interruttori on/off della trasduzione
redox; ii) il coinvolgimento di vie di fosforilazione di proteine coordinate da
protein chinasi delle classi PKC e MAPK; iii) l’attivazione di fattori di
trascrizione redox sensibili, tra cui NF-kappaB, Nrf2, Jun/AP1 e p53.
Sarà inoltre esaminato l’effetto
sulle stesse vie di trasduzione del segnale di un molteplice gruppo di specie
ossidanti e fisio-patologicamente attive nell’induzione di stress ossidativo:
ROS, disolfuri di varia origine, RNS, chemioterapici, raggi UV e sottoprodotti
di definite classi di lipidi ossidati, quali quelli appartenenti alla famiglia
degli ossisteroli.
In particolare, si definiranno i
meccanismi molecolari responsabili della decisione tra sensibilità e resistenza
all’apoptosi (Unità Ciriolo, Pronzato, Cimino, Casini) e tra induzione e
arresto della proliferazione cellulare (Unità Poli, Cimino, Pronzato) mediante
l’identificazione e la caratterizzazione di vie fisiologiche attivate da
modificazioni lievi o moderate dello stato redox cellulare.
In questo ambito studieremo anche
l’integrità e la funzionalità mitocondriale, quale punto di convergenza di
diverse malattie neurodegenerative (Unità Ciriolo); nuovi target molecolari di
p53 e Nrf2, correlati alla resistenza all’apoptosi e alla senescenza (Unità
Ciriolo, Cimino); il ruolo della glutatione transferasi omega 1 (GSTO1) nella
resistenza allo stress ossidativo e alla chemioterapia, allo scopo di chiarire
il ruolo di questa nuova categoria di enzimi nell'equilibrio redox cellulare e
nella regolazione del processo apoptotico, (Unità Casini, Ciriolo, Pronzato).
Inoltre, saranno analizzati i
livelli di espressione di alcuni microRNA in risposta allo stress ossidativo,
allo scopo di utilizzarli come probabili “indicatori” di senescenza cellulare
(Unità Cimino). Quali sistemi sperimentali, saranno utilizzati modelli
cellulari di neurodegenerazione, cancro e aterosclerosi, già precedentemente
studiati e caratterizzati nei laboratori dei diversi gruppi afferenti al
programma e che saranno, inoltre, materiale di scambio e di integrazione fra
gli stessi gruppi.
L’analisi dei risultati ottenuti
dalla modulazione della trasduzione delle vie del segnale, in cellule esposte
ad alterazioni dello stato redox, permetteranno in primo luogo di ampliare le
conoscenze sulle alterazioni di questi “pathways” nei modelli sperimentali
considerati e di ipotizzare strategie preventive o terapeutiche per malattie o
condizioni in cui il coinvolgimento dello stress ossidativo nell’induzione e/o
nella fase conclamata è un evento noto, quali invecchiamento, cancro,
neurodegenerazione, e aterosclerosi. Scopo finale del progetto di ricerca è
quindi di fornire un valido contributo alle conoscenze di base della
segnalazione redox, nonché di applicare le informazioni ottenute alla
comprensione di importanti patologie umane.
Coordinatore Scientifico del
Programma di Ricerca
Maria Rosa Ciriolo Università degli
Studi di ROMA "Tor Vergata"
Obiettivo del Programma di Ricerca
L’obiettivo del presente programma
di ricerca è la comprensione dei meccanismi molecolari alla base delle vie di
trasduzione del segnale redox che determinano la differente risposta cellulare
in dipendenza della natura/intensità dello stimolo redox applicato in modelli cellulari
riconducibili a condizioni e stati patologici quali cancro, neurodegenerazione,
senescenza e aterosclerosi. Di seguito sono riportati in dettaglio gli
obiettivi per ciascun pacchetto di lavoro compreso nel presente
progetto.
1.
Cancro
I processi alla base
della trasformazione tumorale sono molteplici, anche se genericamente
accomunabili nella concomitante deregolazione dei processi di proliferazione e
morte cellulare.
Le evidenze scientifiche, in merito
al ruolo dello stress ossidativo nei processi di tumorigenesi, sembrano essere
duplici: se da un lato esso è implicato nell’insorgenza delle mutazioni
responsabili della trasformazione neoplastica con induzione incontrollata della
proliferazione e insorgenza della resistenza, dall’altro può rappresentare uno
strumento per indurre selettivamente la morte delle cellule nella fase di
progressione tumorale. In quest’ambito gli obiettivi saranno:
A) Chiarire il ruolo della
segnalazione redox, dalle MAP chinasi a monte (JNK, p38MAPK, ERK1/2) ai fattori
di trascrizione a valle (Nrf2, NF-kappaB, AP-1), nella modulazione
dell’apoptosi indotta da stimoli ossidativi di diversa natura, al fine di
comprendere le cause della diversa suscettibilità (morte/resistenza) allo
stress ossidativo in cellule trasformate di diversa origine.
B) Identificare bersagli molecolari
modulati dallo stato redox intracellulare e coinvolti nella via di segnalazione
dipendente da PKC-delta capaci di innescare l’apoptosi o il
differenziamento.
C) Caratterizzare il signaling
dipendente da PKC delta nel controllo redox del ciclo cellulare e del
differenziamento utilizzando un’ampia gamma di linee tumorali esprimenti vari
livelli di MYCN
D) Chiarire il ruolo nel processo
apoptotico della glutatione transferasi omega 1 (GSTO1), in particolare nella
resistenza ai farmaci e agli agenti pro-ossidanti.
E) Chiarire i meccanismi molecolari
che regolano l’espressione della GSTO1, in particolare il coinvolgimento dei
fattori di trascrizione redox-regolati (NFkB, AP-1 e Nrf2).
F) Definire i meccanismi molecolari
che caratterizzano l’inibizione p53-mediata dei geni antiossidanti dipendenti
da Nrf-2, tramite l’uso di mutanti di p53 nella regione C-terminale.
2. Neurodegenerazione
I
risultati sperimentali ottenuti negli ultimi anni indicano nei processi di morte
cellulare (per apoptosi e/o autofagia) la causa principale cui attribuire la
perdita progressiva del numero di neuroni del sistema nervoso centrale.
In questo contesto, il morbo di
Parkinson è tra le malattie neurodegenerative più diffuse e maggiormente
studiate.
Nonostante lo stress
ossidativo/nitrosativo rappresenti un marcatore di tale patologia le reali
cause che innescano le vie di trasduzione del segnale che conducono alla morte
neuronale non sono state ancora del tutto identificate.
In questo ambito gli obiettivi saranno:
A) Caratterizzare il ruolo svolto
dalla perdita della funzionalità mitocondriale nell’eziologia/progressione del
morbo di Parkinson (PD) attraverso l’uso di modelli cellulari di PD.
B) Determinare l’eventuale
coinvolgimento dell’NO e dell’NO sintasi neuronale nel PD focalizzando lo
studio alla regolazione della produzione di NO a livello mitocondriale
C) Identificare il ruolo degli
ossisteroli nella neurodegenerazione nel PD.
D) Caratterizzare gli effetti
anti-ossidanti e cito-protettivi di molecole redox attive esogene (DADS e
campferolo) sulla segnalazione redox, con particolare attenzione alla loro
azione sulla funzionalità mitocondriale e sulla vitalità della cellula
nervosa.
3. Senescenza
Un processo
considerato meccanismo di soppressione tumorale in vivo ed alternativo
all’apoptosi, così come possibile contributore dell’invecchiamento tissutale, è
la senescenza cellulare, uno stato di arresto permanente del ciclo cellulare
indotto da vari stimoli, che limita l’eccessiva o aberrante proliferazione
cellulare.
Un grosso contributo
all’instaurarsi della senescenza è dato dal calo della difesa antiossidante ed
in modo particolare del GSH e/o del rapporto GSH/GSSG. Lo sbilancio redox
dovuto alla deplezione di GSH porta ad esempio alla senescenza in fibroblasti
embrionali umani.
Altro aspetto basilare nella
modulazione dello stato redox cellulare durante l’invecchiamento é dato
dall'omeostasi del GSH nella lente, dove il mantenimento di appropriati livelli
di GSH in forma ridotta, ne garantiscono la trasparenza.
Infatti, durante l'invecchiamento
l'insorgenza della cataratta è associata ad una alterazione dei livelli di GSH
e/o del rapporto GSH/GSSG nel cristallino e in altri distretti. In questo
ambito gli obiettivi saranno:
A) Definire il ruolo dei miRNA
nell’induzione della senescenza cellulare /invecchiamento sotto stress
ossidativo di varia natura (depletanti di GSH, raggi UV, H2O2) in fibroblasti
umani e cellule di sangue periferico di individui giovani ed anziani.
B) Chiarire i processi di
regolazione mediati da Nrf2 e p53 dell’espressione di miRNA indotti in
condizioni di senescenza.
C) Caratterizzare a livello
strutturale e funzionale la cistationina gamma liasi, enzima principale nei
processi di transulfurazione che portano alla formazione della cisteina e
quindi del GSH. Tale obiettivo avrà lo scopo di definire sia la sua
suscettibilità ad un’azione modulatoria diretta ad opera di intermedi del ciclo
del gamma glutammile, sia la sua capacità di generare sulfani.
D) Valutare la suscettibiltà della
cistationina gamma liasi a processi di modifica covalente reversibile
(S-tiolazione) e irreversibile (carbonilazione) ed il loro effetto
sull’attività catalitica dell’enzima e le possibili relazioni tra omeostasi del
glutatione e livelli di attività cistationina gamma liasica in cristallini
intatti e in cellule epiteliali di cristallino in coltura.
4. Aterosclerosi
Tra i
prodotti di ossidazione dei lipidi delle membrane cellulari, i derivati
ossidati del colesterolo (ossisteroli) suscitano interesse nella fisiopatologia
dell’invecchiamento, e sembrano essere coinvolti nell’induzione dei segnali di
morte per apoptosi delle cellule vascolari negli stadi più avanzati del
processo di aterosclerosi.
Recenti ricerche hanno evidenziato
un ruolo degli ossisteroli nel modulare anche segnali di sopravvivenza
cellulare; tuttavia a tal riguardo non sono ancora disponibili dati
sufficienti.
In questo ambito gli obiettivi
saranno:
A) Chiarire il ruolo dell'attività
della NADPH ossidasi e della relativa produzione di specie reattive
dell’ossigeno (ROS) nell'azione pro-apoptotica che alcuni ossisteroli di
interesse fisiopatologico sembrano esercitare su macrofagi, cellule muscolari lisce
ed endoteliali.
B) Caratterizzare le vie di segnale
PKC, PYK2, ERK e la via PI3K/Akt con la specifica attivazione di fattori
trascrizionali quali IkB-chinasi (IKK), YAP, CREB, quali meccanismi di
sopravvivenza o per lo meno di ritardo della morte cellulare
programmata.
C) Definire in maniera dettagliata
la via mitocondriale dell'apoptosi potenzialmente attivata e modulata dagli
ossisteroli: ruolo dell’iperproduzione di ROS con variazioni nell’espressione
di geni coinvolti nell’apoptosi mitocondrio-mediata quali PKC, PYK2, ERK e
PI3K/Akt.
D) Identificare il possibile ruolo
protettivo di alcuni antiossidanti naturali nei confronti dell’apoptosi indotta
dagli ossisteroli.
Risultati parziali attesi
I risultati attesi da questo
programma di ricerca sono riportati suddivisi per argomenti che identificano
condizioni o patologie associate a stress ossidativo, rispettando la
suddivisione delineata nello stato dell’arte del progetto.
CANCRO
A. Ruolo dello status tiolico
intracellulare, e della attivazione esclusiva di classi di MAP chinasi e di
fattori di trascrizione redox sensibili quali interruttori molecolari che
determinano il grado di suscettibilità allo stress ossidativo in istotipi
tumorali di varia origine.
Risultati ottenuti in precedenza e dati
preliminari dell’U.O. Ciriolo depongono a favore di una diversa suscettibilità
allo stress ossidativo di diversi istotipi tumorali.
Questa caratteristica può essere
riassunta nella diversa disponibilità cellulare di antiossidanti e di una
esclusiva attivazione di vie fosforilative mediate dalle MAPK. Sulla base di
questi dati e di quanto progettato, l’U.O. Ciriolo si aspetta di:
1) Chiarire i meccanismi molecolari
alla base della diversa risposta di cellule tumorali a stimoli ossidativi di
varia natura.
2) Caratterizzare il “corredo
redox” e il grado di suscettibilità di diversi isotipi tumorali a diversi
agenti ossidanti.
Questo ci permetterà di selezionare
classi di chemioterapici a diversa azione pro-ossidante su linee tumorali con
diverse caratteristiche redox e ipotizzare uno screening specifico per le
proteine e i fattori redox sensibili al fine di ottimizzare l’approccio
chemioterapico.
B. Ruolo dello stress ossidativo
nella segnalazione mediata da PKC delta e suo coinvolgimento nella regolazione
del differenziamento e della morte cellulare.
La prognosi avversa del
neuroblastoma è ampiamente associata con l’amplificazione o l’overespressione
dell’oncogene MYCN, sebbene le conseguenze molecolari e biologiche di questa
alterazione genetica siano ancora poco chiare. Risultati precedenti dell’U.O.
Pronzato hanno dimostrato che MYCN, in associazione con farmaci citotossici, è
in grado di innescare con successo la via apoptotica mitocondriale.
Inoltre, l’aumento di produzione di
ROS ed il calo delle difese antiossidanti conseguenti alla deplezione di GSH,
determinano l’induzione dell’apoptosi mitocondriale, mentre la deplezione
sperimentale di GSH da sola non è sufficiente a indurre la morte cellulare
programmata.
La trasformazione neoplastica delle
cellule è caratterizzata da una anormale crescita accompagnata dalla perdita
del differenziamento.
Il rallentamento del ciclo
cellulare ed il differenziamento sono quindi fenomeni ovviamente auspicabili
nel trattamento delle neoplasie e lo studio dei meccanismi molecolari e delle
alterazioni dei sistemi di trasduzione del segnale che sottendono questi
fenomeni rivestono una indubbia importanza.
Molte sono le evidenze sperimentali
che correlano la modulazione dello stato redox intracellulare al blocco del
ciclo ed al differenziamento, che a loro volta alterano l’attività della PKC.
Sulla base di questi dati e di
quanto progettato, l’U.O. Pronzato si aspetta di:
1) Chiarire i meccanismi
molecolari apoptotici in cellule di neuroblastoma sovresprimenti MYCN e
diventate insensibili ai segnali di morte mediati da recettore;
2) Caratterizzare il ruolo di
PKC-delta quale mediatore principale del meccanismo ossidativo apoptotico e
induttore del blocco del ciclo cellulare e del differenziamento.
Queste evidenze validate su animali
ci consentiranno di aggiungere importanti conoscenze nella terapia oncologica.
La ricerca di substrati specifici
regolati dallo stato redox e dall’attività di PKC-delta potrà essere di aiuto
nell’approccio clinico del neuroblastoma.
C. Studio del ruolo
antiapoptotico e della regolazione dell’espressione della GSTO1
umana
Dati in possesso dell’U.O. Casini depongono a favore di un ruolo
fondamentale della GSTO1 nella modulazione del ciclo cellulare, nonché nella
resistenza allo stress ossidativo e ai chemioterapici. Sulla base di questi
dati e di quanto progettato, l’U.O. Casini si aspetta di:
1) Chiarire il ruolo della GSTO1
nei meccanismi che regolano l’apoptosi.
2) Caratterizzare i meccanismi che
regolano l’espressione di GSTO1.
Questi risultati miglioreranno le
nostre conoscenze circa i meccanismi di morte e sopravvivenza cellulare. In
particolare un ruolo antiapoptotico di GSTO1 nei confronti di noti farmaci
antitumorali come il cisplatino, potrebbe avere potenzialità applicative: la
sovraespressione di GSTO1 in tumori umani potrebbe infatti costituire un marker
di chemioresistenza e contribuire ad orientare la terapia antitumorale.
Inoltre, miglioreranno le
conoscenze sui meccanismi di espressione genica redox-regolati.
D. Studio dei meccanismi molecolari
attraverso cui p53 inibisce l’espressione dei geni sotto il controllo di
Nrf2.
Risultati recenti ottenuti
dall’U.O. Cimino hanno messo in evidenza il cross-talk tra Nrf2 e p53 nella
regolazione della risposta antiossidante mediata da Nrf-2. Sulla base di questi
dati e di quanto progettato, l’U.O. Cimino si aspetta di:
1) Definire i meccanismi
molecolari alla base dell’inibizione mediata da p53 sull’espressione di geni
antiossidanti sotto il controllo di Nrf2.
2) Identificare l’esistenza di uno
o più residui su p53 coinvolti nella repressione dei promotori dei geni
antiossidanti a valle di Nrf2.
Quanto proposto è di rilevante
interesse in quanto lo stress ossidativo è correlato all’invecchiamento e al
cancro.
Gli effetti pro- e antiossidanti di p53 sono
una barriera contro le alterazioni genetiche coinvolte nella generazione del
tumore. Infatti, la perdita di p53 in modelli in vivo aumenta i livelli
intracellulari di ROS e accelera la crescita tumorale. Si può quindi ipotizzare
che cellule resistenti allo stress ossidativo possono essere soggette a un
rischio maggiore di trasformazione neoplastica rispetto a cellule suscettibili.
E’ comunque indubbio l’associazione
tra resistenza allo stress ossidativo e resistenza ai trattamenti
chemioterapici, infatti, molti dei composti appartenenti a questa classe di
farmaci induce morte per apoptosi producendo stress ossidativo.
2.
NEURODEGENERAZIONE
Studio degli effetti anti-ossidanti e cito-protettivi
di molecole redox attive sulla segnalazione redox, sulla funzionalità
mitocondriale e sulla vitalità della cellula nervosa in modelli in vitro di
morbo di Parkinson (PD).
Dati precedenti hanno confermato
la duplice azione (pro- e anti-ossidante) di molecole redox attive presenti
nella dieta (molecole organosolfuriche e polifenoli che) o endogenamente
prodotti (NO e ossisteroli). Questo si traduce in una dicotomia negli effetti
indotti da queste molecole sulla progressione del ciclo cellulare e sul destino
della cellula (pro- e anti-apoptotiche) in dipendenza della concentrazione a
cui si ritrovano.
I processi neurodegenerativi
mostrano quale causa scatenante o sono spesso accompagnati da alterazioni
ossidative croniche che si traducono in ultima analisi nella perdita selettiva
di determinate popolazioni neuronali (es. cellule dopaminergiche nel morbo di
Parkinson).
Sulla base di questi dati e di
quanto progettato, l’U.O. Ciriolo si aspetta di:
1) caratterizzare gli effetti
protettivi delle molecole redox sopra citate (NO, DADS, campferolo e
ossisteroli) sulla morte neuronale in modelli cellulari di neurodegenerazione
riconducibili al morbo di Parkinson (PD).
2) Identificare nuovi target
molecolari, specifici per le cellule nervose, modulati dai ROS e dagli
RNS.
3) Caratterizzare gli effetti degli
ossisteroli sulla neurodegenerazione del PD.
Le conoscenze acquisite potranno
essere traslate in campo clinico per ipotizzare l’uso di molecole redox di
derivazione alimentare nella prevenzione del PD e contemporaneamente sviluppare
nuovi farmaci che intervengono sulle vie metaboliche modulati dall’NO o dagli
ossisteroli , per la cura del PD.
3. SENESCENZA
A. Regolazione dell’espressione di
alcuni microRNAs nell’induzione della senescenza
cellulare/invecchiamento
La deplezioni di GSH indotta da basse dosi di
DEM induce un fenotipo senescente in fibroblasti umani.
Risultati preliminari ottenuti
dall’U.O.
Cimino attraverso uno screening di
380 miRNA indicano la possibilità di una associazione tra espressione di almeno
cinque miRNA e la senescenza indotta da DEM.
Sulla base di questi dati e su
quanto progettato l’U.O.Cimino si aspetta di:
1) Confermare l’esistenza
di una relazione funzionale tra espressione selettiva di alcuni miRNA e
senescenza cellulare.
2) Generalizzare il fenomeno
comparando analisi condotte su fibroblasti e cellule del sangue periferico
provenienti da individui giovani con quelli provenienti da individui
anziani.
Questo permetterebbe un uso
potenziale dei livelli di miRNA quali marker molecolari
dell’invecchiamento.
B) Ruolo della cistationina gamma
liasi nell’omeostasi del GSH e della proliferazione cellulare nel
cristallino
Tra i processi degenerativi tipici dell’invecchiamento la
cataratta è uno dei più conosciuti.
L’ossidazione delle cristalline e
la mancanza di un sistema antiossidante autosufficiente e rigenerabile fa sì
che solo il GSH agisca attivamente contro le ossidazioni irreversibili.
La disponibilità di GSH che, nel cristallino,
in buona parte dipende dai processi di trans-sulfurazione è quindi uno step
fondamentale nell’assicurare una difesa anti-ossidante efficiente. La
cistationina gamma-liasi (CGL) è uno degli enzimi chiave nel rendere
disponibile cisteina, e quindi GSH al cristallino. Sulla base di questi dati e
su quanto progettato, l’U.O.Casini si aspetta di:
1) Isolare e caratterizzare la CGL
da lenti di vitello.
2) Valutare le possibili relazioni
tra omeostasi del GSH e livelli di attività CGL in cristallini intatti e in
cellule epiteliali di cristallino in coltura.
La diminuzione dei livelli di
cistationina gamma liasi osservata nell’invecchiamento, nonché l’associazione
di una tale diminuzione con l’insorgenza del processo della cataratta, rendono
lo studio di isolamento e caratterizzazione di questo enzima dalla lente
particolarmente rilevante nella chiarificazione dei meccanismi che nel
cristallino garantiscono l’omeostasi del glutatione e che, conseguentemente,
sono alla base del mantenimento della trasparenza della lente. Inoltre, la
potenzialità di tale enzima di contribuire, attraverso la produzione di
composti contenenti zolfo sulfanico, alla generazione di acido sulfidrico,
rende la caratterizzazione di tale proteina rilevante ai fini di comprendere le
eventuali connessioni tra omeostasi del glutatione e controllo della
proliferazione cellulare.
4. ATEROSCLEROSI
Studio dei
segnali cellulari di apoptosi e/o sopravvivenza indotti da prodotti di
ossidazione del colesterolo nel rimodellamento vascolare in corso di
aterosclerosi
Il punto di partenza è rappresentato dall’osservazione che in
cellule vascolari trattate con singoli ossisteroli hanno il sopravvento segnali
di morte per apoptosi, mentre in cellule trattate con identiche concentrazioni
di miscele di ossisteroli, di effettivo riscontro in fisiopatologia, prevalgono
segnali di sopravvivenza cellulare. Sulla base di questi dati e di quanto
progettato, l’U.O.
Poli si aspetta di:
1) Evidenziare i principali geni e
relativi prodotti coinvolti nella trasduzione di segnali di morte e di
sopravvivenza.
2) Chiarire i meccanismi molecolari
che permettono, nelle cellule trattate con miscele di ossisteroli, il prevalere
dei segnali di sopravvivenza.
I risultati ottenuti saranno di
grande interesse nell’identificazione di nuovi marker aterosclerotici e utili
nell’ipotizzare nuovi approcci per un trattamento futuro
dell’aterosclerosi.
Durata
24 mesi
Base di partenza scientifica
nazionale o internazionale
Numerosi dati sperimentali indicano
un ruolo centrale dello stress ossidativo in diversi processi fisio-patologici
quali invecchiamento e carcinogenesi, così come nell’insorgenza di numerose
malattie neurodegenerative e vascolari. Le specie reattive dell’ossigeno (ROS)
sono il risultato della riduzione parziale dell’ossigeno e rappresentano quindi
sottoprodotti fisiologici del metabolismo ossidativo.
Tra le fonti di ROS, la NAD(P)H
ossidasi e il mitocondrio rivestono il ruolo di maggiori produttori endogeni;
alternativamente, stress chimici e fisici di varia natura come raggi UV, gas
inquinanti, farmaci e xenobiotici (es. chemioterapici, quali le antracicline)
possono ugualmente generare ROS a concentrazioni elevate.
Tra le modificazioni ossidative
mediate dai ROS quelle a carico dei lipidi sono state tra le prime ad essere
studiate ed identificate.
Di recente acquisizione è
l’evidenza che oltre ai fosfolipidi anche il colesterolo rappresenta un
bersaglio dell’azione ossidativa dei ROS dando luogo alla formazione degli
ossisteroli.
Sempre maggiore è l’interesse che
gli ossisteroli, suscitano in fisiopatologia umana, in particolare nelle
patologie correlate all’invecchiamento, per la loro potenziale capacità di
modulare numerose vie di segnalazione cellulare.
Un aumento dei livelli tessutali di
ossisteroli è stato associato al danno della parete vascolare in corso di
aterosclerosi. Gli ossisteroli partecipano al processo di aterogenesi non solo
mediante attivazione di risposte pro-infiammatorie e pro-fibrogeniche, ma anche
contribuendo durante gli stadi più avanzati del processo alla morte per
apoptosi delle cellule vascolari.
Studi condotti in modelli in vitro
hanno caratterizzato il potenziale effetto pro-apoptotico dei principali
ossisteroli in cellule vascolari.
Il 7-chetocolesterolo ed il 7beta-
inducono apoptosi in cellule muscolari lisce ed in cellule endoteliali. L’U.O.
Poli ha precedentemente osservato apoptosi indotta da 7-chetocolesterolo sia in
cellule promonocitiche umane, sia in macrofagi murini già a basse
concentrazioni.
La tossicità di questi composti
sembra coinvolgere la produzione di ROS via NADPH ossidasi. Recentemente è stata
evidenziata la complessità dei segnali che regolano l’apoptosi indotta nei
macrofagi dal 7-chetocolesterolo, in cui si evidenzia aumento del calcio
citosolico, attivazione delle proteine pro-apoptotiche Bad e Bim ed inibizione
di Bcl2.
Il dato più rilevante è, però, l'inaspettata
attivazione della via di sopravvivenza, che coinvolge una tirosin-chinasi ricca
in prolina (PYK2) e l’induzione della via delle MAPK mediata da ERK che
potrebbe rappresentare un valido meccanismo anti-apoptotico. Inoltre, un crescente
numero di evidenze sperimentali indica nell’attivazione della via
fosfatidilinositol-3-chinasi (PI3K)/Akt un meccanismo primario di produzione di
segnali di sopravvivenza.
I ROS possono alterare irreversibilmente anche
la struttura del DNA e indurre in tal modo la trasformazione neoplastica.
D’altro canto, è ormai largamente dimostrato che l’aumentata velocità di
replicazione delle cellule neoplastiche è associata ad un aumento della
concentrazione dei ROS intracellulari che mediano positivamente la progressione
del ciclo cellulare.
Le cellule trasformate, infatti, possono
sviluppare un’elevata resistenza allo stress ossidativo e non essere più
sensibili all’apoptosi che ne impedirebbe la proliferazione incontrollata.
I fenotipi molecolari che caratterizzano
la resistenza cellulare sono, infatti, associati oltre che ad alterazione di
geni che regolano il ciclo cellulare e alla mancanza di proteine coinvolte
nella mediazione dell’apoptosi, anche all’elevata espressione degli enzimi
antiossidanti e dei sistemi di riparo del DNA.
La cellula tumorale, quindi, adatta
il proprio stato redox in maniera da modulare la segnalazione cellulare che
dipende dalle alterazioni ossido-riduttive. Questo si basa sulle proprietà
redox di alcune cisteine proteiche denominate “reattive”, che reagendo
reversibilmente con i ROS o con le specie reattive dell’azoto (RNS) sono in
grado di generare derivati solfenici (-S-OH), ponti disolfuro intra- e
inter-molecolari (-S-S-) o nitrosotioli (-S-NO), specie molecolari che possono
essere efficientemente ridotte allo stato iniziale tramite sistemi enzimatici
rappresentati dalla tioredossina/glutaredossina reduttasi e dalla glutatione
reduttasi.
Dati sperimentali, negli ultimi
anni, hanno dimostrato una regolazione di tipo redox a livello delle cisteine
di numerose proteine enzimatiche e strutturali che ne media l’attivazione o
inibizione reversibile della funzionalità.
Tra queste di particolare importanza sono
alcune famiglie di proteine segnalatorie tra cui le protein chinasi attivate da
mitogeni (MAP chinasi) e la protein chinasi C (PKC) e diversi fattori di
trascrizione come Nrf2, Jun/AP-1, NF-kB e p53 la cui modulazione porta ad
alterazione del ciclo cellulare o della morte programmata.
La regolazione dell’attività degli
enzimi appartenenti alla superfamiglia delle MAP chinasi, JNK, p38MAPK e
ERK1/2, rappresenta uno dei prototipi di segnalazione redox. Queste proteine
sono il fulcro dei processi cellulari che si interpongono tra i due estremi
morte cellulare/sopravvivenza (passando per la regolazione del ciclo cellulare)
attraverso la modulazione diretta della propria attività dalle alterazioni
dello stato ossido-riduttivo intracellulare. Le proteine cui è da associarsi la
raccolta dell’informazione relativa allo sbilanciamento redox sono la
tioredossina e la glutatione-S-transferasi P1 (GST-P1), poiché interattori e
modulatori negativi rispettivamente della chinasi a monte di p38MAPK (ASK1) e
di JNK.
Anche in questo caso, la funzione
di sensori redox è da ricondursi allo stato di ossidazione di cisteine reattive
che modificano la struttura garantendo il rilascio e la successiva attivazione
delle chinasi che, in ultima analisi, portano all’innesco di cascate
fosforilative in grado di amplificare il segnale e di dar vita alla risposta
cellulare. Dati recenti dell’U.O. Ciriolo hanno evidenziato che l’esclusività
di risposta a diversi tipi di stress ossidativo (morte o resistenza) dipende
proprio dal corredo e dal grado di induzione delle MAPK.
Ad esempio, stimoli pro-ossidanti
di tipo disolfurico sono in grado di indurre apoptosi in cellule promonocitarie
attraverso p38MAPK, mentre non hanno effetti citotossici su linee di
neuroblastoma. D’altro canto, se queste ultime vengono sottoposte a stress
ossidativo ROS-dipendente, attivano la via fosforilativa modulata da JNK/c-Jun
e risultano molto più sensibili rispetto a cellule di adenocarcinoma gastrico.
Esiste quindi una fitta rete di
segnali che nasce da un singolo impulso ossido-riduttivo (produzione di ROS,
alterazioni dei livelli di GSH, ecc.), si propaga attraverso vie fosforilative
mediate dalle MAPK, confluisce nell’attivazione esclusiva di alcuni set di geni
e determina in tal modo una risposta esclusiva per ogni tipo cellulare allo
stimolo redox applicato. Quanto detto assume ancora più importanza se applicato
a cellule trasformate, dove i livelli di ROS sono più elevati e l’attività
delle MAP chinasi attivate da stress alterati rispetto a cellule differenziate.
L’esempio delle MAPK non è comunque
isolato nella regolazione dell’attività fosforilativa di protein chinasi che
regolano il destino di una cellula sottoposta a stress.
Infatti, la sensibilità della
famiglia PKC allo sbilancio ossidativo e l’esistenza di isoforme pro- ed anti-
apoptotiche suggerisce che anche la PKC può agire come un sensore molecolare
redox capace di promuovere sopravvivenza o morte cellulare a seconda
dell’isoforma esaminata.
La PKC è una famiglia di isoenzimi
soggetta ad una complicata regolazione redox: l’enzima, generalmente attivato
dagli esteri del forbolo (PMA) o dal diacil glicerolo e regolato dalla
fosforilazione, dai lipidi e dal calcio, può subire selettive modificazioni
ossidative a livello del dominio regolatorio attivando la molecola ed a livello
del dominio catalitico inibendola completamente. L’isoforma delta, oltre ad
essere un target specifico della regolazione redox è anche coinvolta nella
produzione di ROS attivando il sistema della NADPH ossidasi.
La PKC delta ha una riconosciuta
valenza anti-proliferativa: molte evidenze sperimentali dimostrano che
l’attivazione di questa isoforma può innescare il fenomeno apoptotico ma è
anche coinvolta nell’arresto del ciclo e nell’induzione del differenziamento.
In cellule di carcinoma del colon l’aumento di espressione di PKC delta causa
arresto in G1 per “down regulation” di ciclina E e D1, mentre l’ inibizione
enzimatica aumenta le cicline E e D1, inibisce p21 ed accelera la crescita. Il
trattamento con PMA, noto attivatore di PKC è in grado di determinare
differenziamento di linee promonocitiche coinvolgendo diversi sistemi
produttori di ROS tra cui NADPH ossidasi e COX2, e attivando MAPK e p21.
Recentemente l’U.O. Pronzato ha dimostrato che il trattamento con acido
retinoico induce differenziamento di cellule di neuroblastoma umano attraverso
l’attivazione di PKC delta e che questo rende le cellule maggiormente sensibili
allo stress glicossidativo. L’identificazione di target molecolari redox
sensibili è di crescente importanza ai fini di un loro possibile impiego nella
messa a punto di nuove strategie antineoplastiche.
Accanto ad un’azione regolatrice
diretta su tali fattori, i ROS/RNS possono agire anche sulle loro proteine
regolatorie; un esempio ben caratterizzato è quello di Nrf2, fattore di
trascrizione normalmente legato ai filamenti di actina tramite Keap1. Un
aumento di ROS o RNS induce modificazioni ossidative di cisteine critiche a
carico di Keap1 che ne permettono il distacco da Nrf2 e la capacità per
quest’ultimo di migrare nel nucleo e legare le sequenze ARE dei geni codificanti
per gli enzimi anti-ossidanti. Recentemente l’U.O. Cimino ha dimostrato una
relazione funzionale negativa tra Nrf2e p53; in particolare i dati ottenuti
mostrano che l’induzione dei geni antiossidanti mediata da Nrf2, che regolano
la risposta di resistenza, è repressa da p53, che è in grado di associarsi ai
promotori di Nrf2 anche in assenza di stress.
Tra i geni regolati da Nrf2, quelli
che trascrivono per gli enzimi della neosintesi del GSH assumono un ruolo
basilare. Il GSH è infatti la molecola antiossidante a basso peso molecolare
più abbondante in ogni compartimento cellulare (1-10 mM).
L’omeostasi del GSH è quindi
fondamentale per la risposta cellulare a condizioni di stress ossidativo sia
per la sua capacità di esistere in diversi stati di ossidazione (ridotto,
ossidato, disolfuro misto con tioli proteici) sia per i diversi sistemi
enzimatici che ne mediano la sua riduzione.
Alterazioni del rapporto forma
ridotta/forma ossidata (GSH/GSSG) determinano grosse ripercussioni sullo stato
redox del compartimento cellulare o della cellula in toto.
Il GSH infatti non solo partecipa
alla rimozione diretta dei ROS e degli RNS, ma gioca un ruolo fondamentale nel
mantenimento dei tioli dei residui reattivi di cisteina.
Recentemente é stata evidenziata una nuova
categoria di enzimi che potrebbero avere un importante ruolo nell’equilibrio
redox e nella regolazione del ciclo cellulare.
Si tratta delle GST omega (GSTO1),
una nuova classe di GST con caratteristiche singolari, poiché presentano
attività deidroascorbato (DHA) reduttasica e tiol-transferasica, importanti nel
mantenimento dell’equilibrio redox cellulare.
Inoltre, dati preliminari dell’U.O.
Casini hanno evidenziato una sovra-espressione della GSTO1 in colture cellulari
umane in situazioni sperimentali che spingono le cellule in fase G0/G1,
suggerendo un probabile coinvolgimento di queste proteine nell’arresto del
ciclo cellulare e nella resistenza ai trattamenti anti-tumorali.
A questi fenomeni si associano gli
elevati livelli di espressione della GSTO1 in cellule resistenti ai
chemioterapici e agli stimoli di morte TNF-mediati, probabilmente determinati
da NF-kB.
Se da una parte la resistenza allo stress ossidativo determina
la progressione tumorale a causa dell’insensibilità al trattamento chemioterapico,
dall’altra parte può rappresentare un mezzo per contrastare l’invecchiamento e
le patologie ad esso correlate quali la neurodegenerazione.
Nell’ultimo decennio, importanti
scoperte hanno contribuito alla comprensione della regolazione della durata
della vita negli organismi inferiori che indicano una forte correlazione tra
resistenza cellulare allo stress ossidativo ed allungamento della durata della
vita.
La senescenza cellulare, oltre ad essere un
meccanismo anti-tumorale alternativo all’apoptosi, può essere considerato un
importante contributo all’invecchiamento di organi, tessuti e, in ultima
analisi, dell’organismo intero.
L’U.O. Cimino ha precedentemente
dimostrato che l’esposizione di fibroblasti umani a basse dosi di dietilmaleato
(DEM), agente in grado di esaurire le riserve intracellulari di GSH,
determinava l’acquisizione di un fenotipo senescente.
Risultati preliminari mostrano una
correlazione tra la senescenza indotta dal DEM e l’aumento dei livelli di
cinque microRNA (miRNA), una nuova classe di piccoli RNA non codificanti che
agisce da regolatori post-trascrizionali inibendo la sintesi proteica mediante
appaiamenti imperfetti con gli mRNA. Durante l'invecchiamento è stata osservata
in svariati organi, una alterazione dei livelli di GSH e/o del rapporto
GSH/GSSG.
Nel cristallino tale alterazione è
stata associata all'insorgenza della cataratta, patologia tipica
dell’invecchiamento, sia in animali modello che nell'uomo.
La rilevanza della via di transulfurazione
quale fonte di cisteina per la sintesi di GSH, già emersa per svariati organi,
è stata recentemente suggerita anche per la lente.
In particolare, in questo
distretto, alterazioni dei livelli di attività della cistationina gamma liasi
(GCL), enzima che catalizza la tappa limitante della via di transulfurazione,
sono state trovate associate sia all’invecchiamento che all’insorgenza della
cataratta, fornendo una plausibile spiegazione della sopra citata diminuzione
dei livelli di GSH. Evidenze dell’U.O. Casini suggeriscono la potenzialità di
una azione regolatoria del dipeptide Cys-Gly sulla sintesi di GSH, attraverso
una possibile modulazione dell’attività CGL. Inoltre, la capacità della CGL di
generare acido sulfidrico attraverso la formazione di derivati sulfanici, rende
la caratterizzazione di questo enzima rilevante al fine di definire nel
cristallino elementi di connessione tra l'omeostasi del GSH, lo stato redox
cellulare e i meccanismi di controllo della proliferazione e morte
cellulare.
La morte neuronale osservata nelle malattie neurodegenerative
è spesso associata allo stress ossidativo/nitrosativo. La comprensione dei
meccanismi molecolari che caratterizzano la neurodegenerazione è di particolare
importanza anche allo scopo di poter suggerire terapie preventive su base
antiossidante che aiutino l’eliminazione dei ROS. I ROS sembrano essere i
principali responsabili della perdita della funzionalità mitocondriale
osservata in tali patologie, specialmente nel morbo di Parkinson (PD). In
particolare, nelle cellule dopaminergiche del pathway nigro-striatale si
osserva anche un incremento della produzione di NO dovuto a un aumento dei
livelli di espressione della NO sintasi inducibile (iNOS) e neuronale (nNOS).
Tale fenomeno sembra essere responsabile della perdita della funzionalità mitocondriale
e dell’accumulo di proteine nitrate nei corpi di Lewy, markers caratteristici
di tale patologia.
A conferma di quanto detto,
evidenze sperimentali dell’U.O. Ciriolo hanno suggerito l’azione anti-ossidante
e mitocondrio-protettiva di alcun molecole redox-attive contenute negli
alimenti e il coinvolgimento dell’nNOS nell’esacerbare la cito-tossicità in
modelli cellulari di PD.
